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Fine AF Consigli da John Reilly (neuroanatomist) Autofocus Microregolazione (AFMA) è una procedura che consente a un utente per correggere piccoli errori di front o back-messa a fuoco. Si tratta di una caratteristica che è presente solo su alcuni modelli di Canon DSLR (attualmente, la 50D, 7D, 5D Mark II, 1D Mark III, 1D Mark IV, 1Ds Mark III, e 1D X). AFMA avrà il massimo beneficio per le lenti con aperture veloci (F2.8 e più ampie), perché il sottile profondità di campo alle massime aperture rende anche piccoli errori di messa a fuoco più evidente. Questo suggerimento è composto da due sezioni principali, una sintesi pratica della procedura per chi vuole immergersi in pieno, seguita da una discussione più tecnica, tra cui alcune opzioni fai da te per una messa a punto di test. Il modo più semplice per eseguire un AFMA è con uno strumento commerciale, come ad esempio il LensAlign MkII o Datacolor SpyderLensCal (vedi la discussione sotto per una spiegazione di difetti comuni di diagrammi di prova stampabili e modelli Moir, e una soluzione ragionevole). Impostare lo strumento su un tavolo o idealmente un piccolo treppiede, e impostare la fotocamera su un treppiede stabile. La distanza tra l'utensile di calibrazione e la telecamera deve essere di circa 25 volte la lunghezza focale della lente (ad esempio 85 mm x 25 2,1 m 7 piedi), anche se ovunque all'interno 5-50x lunghezza focale funzionerà. Si noti che la distanza di 25x lunghezza focale è indipendente dalla dimensione del sensore 7 piedi sarebbe appropriato per un obiettivo 85 millimetri su APS-C, APS-H, o FF. Se si sta regolando un obiettivo zoom, basare la distanza della lunghezza focale più lunga, ed eseguire la calibrazione in quel lungo lunghezza focale (si noti che la nuova 1D X consente di calibrare un obiettivo zoom con due valori di regolazione separate per la lunga e larghe estremità). Per lunghi lenti, hai bisogno di una discreta quantità di spazio. Puntare la fotocamera in modo che il punto centrale AF è centrato sul bersaglio fuoco, e allineare la telecamera in modo che il piano del sensore è parallelo al focus target (utilizzando le porte a vista nella LensAlign, o garantendo entrambi sono livello per il SpyderLensCal). L'illuminazione è importante - idealmente, luminoso l'illuminazione costante sia per il target di messa a fuoco e il principe, con illuminazione per quest'ultimo angolata per evitare riflessione. Io suggerisco di usare un paio di lampade da tavolo, una illuminazione del righello da angolo alto, l'altra illuminazione l'obiettivo di messa a fuoco. Io in realtà uso tre lampade, ciascuna da 150 W-equivalente. Ecco ciò che la mia configurazione tipica si presenta come: Se opportuno, istituito a sparare tethered (youll necessità di rivedere le immagini a 100). Impostare la fotocamera in modalità Av, apertura massima, e per questo scopo del suo meglio per girare in formato JPG con il Picture Style impostata su Monocromatico (se si spara a colori con una lente come la 50L o 85L, essere pronti a vedere un sacco di longitudinale CIRCA). Utilizzare un rilascio a distanza o l'autoscatto e la funzione di blocco dello specchio. Accedere alle impostazioni per la fine AF (nella sezione AutofocusDrive) C. Fn e scegliere 2: Regolare lente. A questo punto, ci sono diversi modi per prendere il vostro scatti di prova. È possibile scattare in modo iterativo staffa a -20, -10, 0, 10, e 20 e vedere quale coppia di che le staffe a fuoco correttamente il punto zero del righello, quindi restringere ulteriormente. In alternativa, si può sparare in ogni impostazione da -20 a 20. Il punto importante è quello di prendere diversi scatti a ciascuna regolazione AFMA, non solo uno o due in particolare nella regione in cui la regolazione finisce, e di prendere almeno alcuni scatti di partenza dalla messa a fuoco all'infinito e alcuni partire dalla distanza di messa a fuoco minima (MFD). Ecco la mia strategia: prendere un colpo a zero e verificare per la parte anteriore o messa a fuoco posteriore (ad esempio, se il piano focale è di fronte al punto zero del righello, thats attenzione anteriore). messa a fuoco anteriore richiede una regolazione positiva per correggere, messa a fuoco posteriore richiede la regolazione negativa. I sparare colpi singoli a partire dal fuoco all'infinito e la revisione al massimo dello zoom sul LCD posteriore, con incrementi di 5 unità poi restringimento ulteriormente, fino a quando ho un ambiente sperimentale AFMA per questo obiettivo. Poi ho sparare a un totale di 11 impostazioni AFMA 5 unità su entrambi i lati della mia scelta preliminare. Ad ogni impostazione, io sparo otto colpi, due a partire da infinito, allora due senza rifocalizzazione, poi due a partire dalla MFD, poi altri due, senza rifocalizzazione. Ho poi trasferire le immagini al computer, e rivederli a 100. DPP mostrerà l'impostazione del AFMA come parte dei dati EXIF ​​(o si può attaccare un post-it al bersaglio con l'impostazione attuale). Ignorare qualsiasi ovviamente fuori colpi di messa a fuoco, in cui nessuna parte del righello è chiaro. Trovo in generale che, come io passo attraverso le immagini, quando si avvicina la regolazione ottimale, i colpi di infinito saranno fuori, poi al miglior regolazione theyll tutto essere a posto, poi come mi allontano i colpi dalla MFD sarà off, o vice versa. Per me, l'intero processo dura circa 30 minuti per ogni combinazione lenscamera. Spesso trovo che 3-4 valori di regolazione sembrano ok (per esempio da 1 a 3, così mi basta usare la media) di solito, una lente diaframma più aperto con diluente DOF offre una gamma più stretta. Alcuni altri bocconcini importanti: la telecamera di memorizzare fino a 20 Rettifiche specifiche-lenti sono di tipo di obiettivo, quindi se avete più di una copia di un obiettivo, la fotocamera sopraelevazione distinguerli (anche se la 1D X può dire loro in base a parte il numero di serie lente) una lente positiva extender conta come una lente aggiuntiva (e devono essere calibrati separatamente dalla lente nudo). Questo è il breve versionread avanti per maggiori dettagli e la teoria, o se preferite, saltare fino alla fine per un suggerimento fai da te per sostituire uno strumento di calibrazione commerciale. Perché è fine AF fotocamere e obiettivi importanti sono realizzati su linee di montaggio, e le tolleranze si applicano a qualsiasi processo di produzione di una specifica desiderata e un intervallo di valori accettabili intorno a quello. Se siete fortunati, si ottiene una macchina fotografica e l'obiettivo che sono sia perfetto, o sono fuori dalla stessa misura e nella stessa direzione, e la vita è buona. Se si dispone di più lenti corpi eo, è probabile che uno o più avrà bisogno di qualche aggiustamento. L'altro fattore è la profondità di campo (DOF) più ampia l'apertura, quanto minore è la DOF. Con aperture relativamente ristretti, quali la gamma f3.5-5.6 comunemente sui obiettivi zoom consumatori, il DOF è abbastanza profonda per mascherare errori fuoco minori, così AFMA non è così importante in quei casi. Ma con le lenti veloci che raggiungono shallow DOF, anche gli errori di messa a fuoco di piccole dimensioni sono molto evidenti. Prima della disponibilità di AFMA, l'unica opzione per correggere questi problemi è stato quello di inviare fotocamera (s) e la lente (es) in Canon e si doveva inviare il vostro intero kit a loro. La necessità di fotografi professionisti per avere quel fatto è stato uno dei motivi per Canon ha lanciato Canon Professional Services. Che cosa è fine AF AFMA corregge distorsione nel sistema AF, o in altre parole, si migliora la precisione globale del sistema AF. La precisione i termini e la precisione sono talvolta (impropriamente) usati come sinonimi - la precisione è la vicinanza al vero, mentre la precisione è ripetibilità. Ecco un esempio schematico: AFMA corregge per la precisione, ma non fa nulla per la precisione. In effetti, si sposta il punto centrale - piano medio focale di misurazioni multiple. Ma è importante ricordare che la precisione gioca un ruolo, quindi, se si prova il sistema AF con un solo o un paio di tentativi, casualità dice il test solito essere posto su a causa di imprecisioni. Così, durante il test delle prestazioni AF, è necessario eseguire prove multiple per un dato obiettivo, e un minor numero di prove sarebbero necessari per un f2.8 o l'obiettivo più veloce a causa della maggiore precisione punto AF attivato da un tale obiettivo. Ho il sospetto che questo è che cosa è dietro Canonici affermazione che AFMA può impedire corretta messa a fuoco - se si basa una regolazione su uno o due scatti di prova, e quei colpi erano relativamente lontano il piano focale corretto, quindi, in media, la maggior parte dei tuoi scatti successivi mancherà di messa a fuoco . Vale la pena notare che, anche se ci prova e impostare AFMA basata sulla profondità di campo, ciò che è effettivamente interessata è la profondità della messa a fuoco. Questo ha senso, in quanto il sistema AF non può controllare cosa di fronte alla lente, ma può controllare cosa succede dietro la lente. Profondità di fuoco si riferisce alla regione di attenzione critica circonda il sensore, e tale regione è una frazione di millimetro di spessore. Canon specifica la precisione del sistema AF essere entro una profondità di fuoco per un'apertura massima lente per punti AF standard di precisione, ed entro 13 della profondità di fuoco per un'apertura massima lente per punti AF ad alta precisione che sono attivati ​​da lenti più veloci (punto centrale f2.8 sulla maggior parte dei corpi, punto centrale f4 sui corpi 1-serie). Una unità di AFMA equivale a 18 della profondità di fuoco di una data apertura massima dell'obiettivo. Nessuna fotocamera produce un'immagine perfettamente a fuoco ogni volta ad ogni distanza, e nessuna procedura di regolazione cambierà questo. Quello che una vera e propria AFMA può fare è aumentare la percentuale di scatti che siano correttamente a fuoco. C'è un modo ancora migliore se la procedura sembra un sacco di lavoro, è Sì, ci sono quasi certamente modi migliori. In un post sul forum Canon Rumors, epsiloneri utente ha descritto un metodo di analisi del contrasto di un obiettivo di messa a fuoco (deviazione standard di intensità dei pixel) e riportando i dati con una misura curva parabolica per determinare l'impostazione migliore AFMA. Questo appare come un metodo molto preciso, anche se probabilmente troppo noioso senza un modo per automatizzare l'analisi (ad esempio MATLAB o ImageJ). In teoria, dovrebbe essere possibile ottenere una messa a fuoco accurata utilizzando rilevamento del contrasto in Live View, in cui è necessario nessun allineamento perché il sensore immagine viene utilizzato per determinare migliore messa a fuoco, quindi confrontare che alla rilevazione di fase AF e corretto di conseguenza. In pratica, questo è qualcosa che questo è difficile da fare (perché l'atto di spostare la ghiera di messa per vedere se sono stati veramente in modo ottimale concentrati cambia la messa a fuoco, e si perde il punto zero). Tuttavia, questa è un'idea che Canon potrebbe attuare come una routine semi-automatico, cioè impostare e allineare bersaglio (Canon potrebbe vendere uno, e opportunamente sovraccaricare per esso come fanno per altri piccoli pezzi di tosse plastica), quindi la fotocamera automaticamente determina la regolazione ottimale. File che uno sotto Gee, wouldnt sarebbe bello se il suo fatto bene, sarà perfetto No, il sistema AF non sarà mai perfetto. Ci sono un paio di grandi ragioni per questo. La prima è che qualsiasi sistema soffre di casualità tutto un accurato AFMA fa è massimizzare la frequenza dei colpi a fuoco si ottiene, ma ci sarà ancora alcuni manca. L'altra ragione è che l'obiettivo di messa a fuoco è una situazione ideale piatta con un elevato contrasto. Il mondo non è composto da obiettivi di messa a fuoco - se fosse, la fotografia sarebbe piuttosto noioso. La complessità delle scene del mondo reale è ulteriormente aggravato dalle nostre aspettative. Si vuole la macchina fotografica e con attenzione posizionare il punto AF sulla funzione del soggetto che si desidera mettere a fuoco. Tuttavia, il sistema AF sopraelevazione leggere la tua mente tutto ciò che può fare è agganciare la regione più alta differenza di fase entro l'area del punto AF. Si noti che il punto AF attuale è maggiore della scatoletta che rappresenta il punto nel mirino. Anche con la funzione Spot AF su alcune fotocamere (7D, 1D Mark IV, e 1D X), che riduce la dimensione effettiva del punto AF, l'area sensibile reale è pari o leggermente superiore alla rappresentazione nel mirino. Così, con alcuni soggetti, in particolare ad angoli acuti per la fotocamera con un sottile DOF, il punto AF può agganciare una delle due funzioni diverse cedendo notevolmente diversi piani focali. Entrambi sarebbe corretta per quanto riguarda il sistema AF è interessato. metodi di prova gratuiti che cosa è sbagliato con loro ci sono un paio approcci per l'esecuzione di AFMA, senza uno degli strumenti commerciali. Uno riguarda la creazione di un Moir indurre modello su un monitor di un computer, e la valutazione di concentrarsi sulla base di Live View sullo schermo LCD telecamere posteriori. Quello è un metodo piuttosto semplice, ma ha due problemi. In primo luogo, la sua difficile allineare la configurazione in modo che il sensore sia parallela allo schermo LCD. In secondo luogo, ho scoperto che c'è un sacco di imprecisione nel metodo durante la visualizzazione di un modello Moir a 10x Live View, la telecamera può essere spostata avanti e indietro un bel po 'senza vedere un notevole cambiamento nel modello sul display LCD posteriore. L'altro approccio libero prevede una tabella di scaricare e stampare, quindi posizione in un angolo di 45 per la fotocamera, si concentrerà su una linea scura e utilizzare le scale sui lati per controllare messa a fuoco. Il problema è che il focus target (line) e la scala DoF sono nello stesso 45 piano, in modo che il bersaglio non è ortogonale al sensore. In realtà, quello che è probabilmente la versione più comunemente utilizzata di quel diagramma era una vecchia versione (ancora disponibile), dove è stato stampato due pagine, poi tagliare uno su come quei vecchi scheda A giocattoli slot B tagliato fuori da una scatola di cereali, e nastrate per l'altra pagina. Il creatore fermato questo approccio a causa della variabilità del gruppo porta a risultati variabili. La versione corrente utilizza una linea orizzontale scura come destinazione fuoco, con la logica che, poiché la linea è orizzontale, Non importa al sistema AF che la pagina è ad un angolo, mostra ancora come una linea orizzontale 2D. Quello è vero, ma allora sta solo per attivare in modo ottimale la parte linea sensibile orizzontale del punto AF. Su molte fotocamere, thats non andare a lavorare bene. xxD corrente e il sensore F2.8 7DS sono un paio di linee diagonali, che significa una sottile linea nera-on-white orientato in senso orizzontale non sta andando per attivare quel sensore. Per la linea RebelxxxD e 5D5DII, il sensore f2.8 è un sensore di linea sensibile verticale che ignora la linea orizzontale sul grafico. Così, quella linea orizzontale è solo andare ad attivare la linea di parte sensibile f5.6 orizzontale del sensore a croce nel punto AF centrale. Ci si potrebbe chiedere - perché il ragazzo fa il grafico del genere direi proprio perché ha progettato per testare AF su fotocamere Nikon, che non hanno la capacità di punto AF ad alta precisione - i loro sensori a croce sono f5.6- sensibile in entrambi gli orientamenti, in modo un obiettivo linea orizzontale dovrebbe essere più che bene. Il migliore approccio fai da te Se non youd piuttosto l'acquisto di uno strumento commerciale per AFMA, il mio consiglio sarebbe quello di ricreare le caratteristiche importanti di questi strumenti con sostituti poco costosi. Heres che cosa Id raccomandare. Ci vorrebbe una scatola di cartone, un libro, un metro a nastro, un bastoncino o una matita, e una stampa di questo target di messa a fuoco (grazie a Bob Williams per il link). Potrebbe essere impostato su un tavolo, o anche il pavimento, se necessario. Se si dispone di un buon treppiede, si usa invece che l'impostazione della fotocamera su un libro. L'obiettivo di messa a fuoco viene registrato al box, giù in basso, e chopstickpencil si blocca in al limite dell'area, in verticale centrato sul bersaglio. Il bastoncino supporta il metro ad angolo. Nota la misura sul metro dove passa accanto al bersaglio - questo è il vostro punto zero contro il quale si può giudicare anteriore o posteriore di messa a fuoco (quando si esaminano le immagini a 100 sul computer). Scegliere un libro di spessore che centra la lente approssimativamente alla stessa altezza del centro del bersaglio fuoco. La configurazione dovrebbe essere simile a questo: spero che questo chiarisce alcune delle insidie ​​nei sistemi AF ed i vantaggi e le modalità di raggiungimento di un utile AFMA. Felice (e Sharp) ShootingNovember 04 2010 Le seguenti informazioni è una versione aggiornata di un metodo per l'utilizzo di ImageJ per analizzare le macchie occidentali da una pagina più vecchio ormai deprecato. Se you8217re alla ricerca di una soluzione del flusso di lavoro più completo per il Western Blot analisi, si prega di visitare il mio tutorial sull'uso Immagine Studio Lite. un pacchetto di software libero da LI-COR Biosciences. L'immagine software Studio Lite può essere scaricato gratuitamente dal licorislite. In aggiunta alle funzionalità descritte di seguito per ImageJ, Immagine Studio Lite fornisce la gestione dei dati aggiuntivi presenta insieme a strumenti di annotazione per la produzione di immagini pronti per la pubblicazione dei vostri western. ImageJ (rsb. info. nih. govijindex. html) può essere utilizzata per confrontare la densità (alias intensità) delle bande su gel di agar o western blot. Questo tutorial presuppone che si è svolto il vostro gel o macchia attraverso il passo di visualizzazione, in modo da avere un'immagine digitale del gel in. tif. jpg. png o altri formati di immagine (a 16 bit tif sarebbero il formato preferito mantenere la massima quantità di informazioni nell'immagine originale). Se si esegue la scansione di pellicola a raggi x su uno scanner piano, assicurarsi di utilizzare uno scanner con la possibilità di eseguire la scansione di lucidi (cioè film), e utilizzare il software dello scanner per salvare le immagini TIFF a 16 bit. Vedere i riferimenti alla fine di questo tutorial per una discussione sui vari modi in cui si può avvitare questo passo. Ciò presuppone anche che si didn8217t sovraesposto l'immagine macchia quando si ha prodotta. Per una spiegazione del motivo per cui sovraesposizione rovinerà i risultati, consultare questa pagina. Il metodo descritto qui utilizza il metodo di analisi Gel descritto nella documentazione ImageJ: Analisi del gel. Si può preferire di usare al posto dei metodi delineare qui di seguito. Ci dovrebbe essere molto piccola differenza tra i risultati ottenuti con i diversi metodi. Questa versione del tutorial è stata creata usando ImageJ 1.42q su un Windows 7 64-bit installazione. 1. Aprire il file immagine utilizzando FilegtOpen in ImageJ. 2. La routine di analisi di gel richiede l'immagine di essere un'immagine in scala di grigi. Il metodo più semplice per convertire in scala di grigi è quello di andare a ImagegtTypegt8 bit. La tua immagine dovrebbe apparire come Figura 1. Figura 1. Un'immagine Western Blot aperto in ImageJ fabbricato. Le informazioni lungo la parte superiore dell'immagine indica che l'immagine è attualmente in modalità 8 bit, utilizzando un LUT invertente (look-up table). La LUT inversione assicura che le bande scure vengono registrati come valori di densità più elevate. 3. Scegliere lo strumento selezioni rettangolari dalla barra degli strumenti ImageJ. Disegnare un rettangolo intorno alla prima corsia. ImageJ presuppone che il corsie corrono verticalmente (in modo singole bande sono orizzontali), in modo che il rettangolo dovrebbe essere alto e stretto per racchiudere una sola corsia. Se si disegna un rettangolo che è corto e largo, ImageJ passerà ad assumere le corsie gestite in orizzontale (singole bande sono verticali), che porta a molta confusione. Figura 2. La prima corsia è stata selezionata con lo strumento Selezione rettangolare 4. Dopo aver disegnato il rettangolo sopra la prima corsia, premere il 1 (Comando 1 su Mac) (Comando 1 su Mac) o andare a AnalyzegtGelsgtSelect prima corsia per impostare il rettangolo in atto. Il 1 ° corsia sarà ora messo in luce e hanno un 1 nel mezzo di esso. 5. Usa il mouse per fare clic e tenere al centro del rettangolo al 1 ° corsia e trascinarlo verso la corsia. È inoltre possibile utilizzare i tasti freccia per spostare il rettangolo, anche se questo è più lento. Centrare il rettangolo sopra la corsia di sinistra a destra, ma don8217t preoccuparsi allineandola perfettamente sullo stesso asse verticale. Immagine-J allineerà automaticamente il rettangolo sullo stesso asse verticale è la 1 rettangolo nel passaggio successivo. 6. Premere 2 (Comando 2 su Mac) o andare a AnalyzegtGelsgtSelect corsia per impostare il rettangolo in atto nel corso del 2 ° corsia. A 2 apparirà nella corsia quando il rettangolo è posto. 7. Ripetere i passaggi 5 6 per ogni successivo corsia sul gel, premendo 2 (Comando 2 su Mac) ogni volta per impostare il rettangolo in posizione (figura 3). Figura 3. Posizionare il rettangolo sopra ogni corsia, premendo 2 ogni volta per impostare il rettangolo in atto. 8. Dopo aver impostato il rettangolo in atto l'ultima corsia (premendo 2), premere 3 (Comando 3 su Mac), o andare a AnalyzegtGelsgtPlot Lanes di tracciare un grafico di profilo di ogni corsia. Figura 4. La trama profilo dall'esempio Western Blot. 9. La trama profilo rappresenta la densità relativa del contenuto del rettangolo sopra ogni corsia. I rettangoli sono disposti dall'alto verso il basso sulla trama profilo. Nell'immagine western blot esempio, i picchi del grafico di profilo (Figura 4) corrisponde alle bande scure dell'immagine originale (Figura 3). Perché c'erano quattro corsie selezionati, ci sono quattro sezioni nel grafico di profilo. i picchi più alti rappresentano bande scure. picchi più larghe rappresentano gruppi che coprono un intervallo di dimensioni più ampia sul gel originale. 10. Immagini di gel reali o macchie occidentali avranno sempre qualche segnale di fondo, in modo che i picchi don8217t arrivano fino alla linea di base della trama profilo. La figura 5 mostra un picco da un vero blot dove c'era il rumore di fondo, in modo che il picco sembra galleggiare sopra la linea di base del grafico di profilo. Sarà necessario chiudere il picco in modo da poter misurare la sua dimensione. Figura 5. Western blot reali hanno spesso qualche rumore di fondo, in modo che il picco doesn8217t raggiungere fino alla linea di base (bianco perfetto). 11. Scegliere lo strumento di selezione linea retta dalla barra degli strumenti ImageJ (Figura 6). Per ogni picco si desidera analizzare nella trama profilo, tracciare una linea attraverso la base del picco per racchiudere il picco (Figura 5). Questo passaggio richiede un po 'di giudizio soggettivo da parte vostra per decidere dove finisce il picco e il rumore di fondo comincia. Figura 6. Utilizzare lo strumento linea retta per chiudere la base di ogni picco di interesse. Figura 7. Il picco della Figura 5 è indicata con una linea tracciata attraverso la base del picco per racchiudere l'area del picco. 12. Si noti che se si hanno molti corsie evidenziate, le corsie successive saranno nascosti nella parte inferiore della finestra profilo trama. Per vedere questi vicoli, premere e tenere premuto la barra spaziatrice, e utilizzare il mouse per fare clic e trascinare la trama profilo verso l'alto. 13. Quando ogni picco è stato chiuso alla base con lo strumento di selezione linea retta, selezionare lo strumento Bacchetta dalla barra degli strumenti ImageJ (Figura 8). Figura 8. Scegliere lo strumento Bacchetta per evidenziare ogni picco di interesse sulla trama profilo. 14. Utilizzando la barra spaziatrice e il mouse, trascinare la trama profilo verso il basso fino a tornare alla prima corsia. Con lo strumento Bacchetta, fare clic all'interno del picco (Figura 9). Ripetere questa operazione per ogni picco, come si va giù la trama profilo. Per ogni picco che si evidenzia, le misure devono pop-up nella finestra Risultati che appare. Figura 9. Fare clic all'interno della 1 ° picco di interesse con lo strumento bacchetta. Il picco dovrebbe essere evidenziata e una misura dovrebbe sollevarsi nella finestra Risultati. 15. Quando tutti i picchi sono stati evidenziati, vai a AnalyzegtGelsgtLabel Peaks. Questa etichette ogni picco con la sua dimensione, espressa come percentuale della dimensione totale di tutti i picchi evidenziati. 16. I valori della finestra Risultati (Figura 10) possono essere spostati in un foglio di calcolo selezionando EditgtCopy Tutto nella finestra Risultati. Incollare i valori in un foglio di calcolo. Figura 10. L'uscita dalla selezione picchi nella trama profilo e l'etichettatura dei picchi. In questo caso, i risultati sono dalla selezione la banda superiore in ciascuna delle 4 corsie nell'esempio Western Blot dalla Figura 1. Nota: Se si fa clic accidentalmente nel posto sbagliato con la bacchetta. il programma ancora record che cliccato zona come un picco, e sarà fattore nella superficie totale utilizzata per calcolare i valori percentuali. Ovviamente questo inclinare i risultati se si fa clic in aree che aren8217t picchi. Se vi capita di fare clic nel posto sbagliato, semplice andare a AnalyzegtGelgtLabel Peaks per tracciare i risultati attuali, che visualizza i valori non corretti, ma ancora più importante reimposta il contatore per la finestra dei risultati. Torna alla trama profilo e iniziare cliccando all'interno dei picchi di nuovo, a partire dal 1 ° picco di interesse. La finestra Risultati deve cancellare e iniziare a mostrare i nuovi valori. Quando you8217re sicuro you8217ve clic in tutte le cime corretti senza fare clic accidentalmente in tutte le aree sbagliate, si può tornare a AnalyzegtGelsgtLabel Peaks e ottenere i risultati corretti. Analisi dei dati con i dati incollati in un foglio di calcolo, è ora possibile calcolare la densità relativa dei picchi. Come promemoria, i valori calcolati da ImageJ sono essenzialmente numeri arbitrari, che hanno significato solo nel contesto della serie di picchi che è stata selezionata l'immagine singola gel you8217ve lavorato in su. Essi non hanno unità di g di proteine ​​o di altre unità del mondo reale che si può pensare. La procedura normale è quello di esprimere la densità delle bande selezionate relative a qualche banda standard che è stato selezionato anche durante questo processo. 1. Mettere i dati in un foglio di calcolo. Uno dei picchi dovrebbe essere il vostro standard. In questo esempio we8217ll utilizzare il 1 ° picco come standard. 2. In una nuova colonna accanto alla colonna Percent, dividere il valore percentuale per ogni campione per il valore percentuale per lo standard (il 1 ° picco in questo caso, 26,666). 3. La colonna risultante dei valori è una misura della densità relativa di ogni picco, rispetto allo standard, che ovviamente hanno una densità relativa di 1. Figura 11. Calcolo densità relativa per ciascuno dei 4 picchi evidenziata. Usiamo Esempio 1 come standard per questo gel. La densità relativa è calcolato dividendo il valore percentuale per ogni campione per il valore percentuale per lo standard. 4. In questo esempio, il 2 ° corsia ha una densità maggiore relativa (1.86), che corrisponde bene con le dimensioni e l'oscurità di quella banda nell'immagine originale (Figura 1). Ricordiamo che questi dati sono per la riga superiore di bande sull'immagine Western Blot originale. 5. Se si desidera confrontare la densità dei campioni su più gel o macchie, sarà necessario utilizzare lo stesso campione di serie su tutti i gel per fornire un riferimento comune quando si calcolano i valori densità relativa. Vedere le sezioni di seguito per una discussione più dettagliata di questi requisiti. 6. Al fine di verificare le differenze significative tra i trattamenti in un esperimento, tutti i gel o macchie dovranno essere analizzati e quantificati con questo metodo, ed i valori saranno espressi in termini di densità relativa, oppure si può trattare Densità relativa come valore pieghevole cambio (cioè una differenza di densità relativa di 2 tra un controllo e trattamento indicherebbe un cambio 2 volte nell'espressione). Se si prevede di utilizzare l'analisi delle tecniche di varianza per verificare i dati, potrebbe essere necessario per assicurare che i valori di densità relativa sono distribuiti normalmente e che non vi è omogeneità della varianza tra i diversi trattamenti. 7. Si deve notare qui che alcuni ricercatori fanno lo sforzo supplementare per includere una serie di diluizioni seriali di uno standard noto su ogni blot. Utilizzando la curva di diluizione in serie e le tecniche di quantificazione di cui sopra, dovrebbe essere possibile esprimere le vostre band di esempio in termini di picogrammi o nanogrammi di proteina. Un esempio più coinvolto con carico-controlli. We8217ll utilizzare Figura 12 come Western Blot rappresentante. In questa macchia, noi far finta che abbiamo caricato di quattro repliche di campioni di proteine ​​(quattro carichi pipetta dalla stessa fiala di omogenato), quindi ci aspettiamo le densità in ogni corsia per essere equivalente. La riga superiore del bar rappresenterà la nostra proteina di interesse. La serie inferiore di barre rappresenterà la nostra proteina di carico-controllo, che ha lo scopo di garantire che una pari quantità di proteine ​​totali è stato caricato in ogni corsia. Questa proteina carico-controllo è una proteina che è presumibilmente espresso ad un livello costante indipendentemente dal trattamento applicato agli organismi originali, come actina (anche se molte persone in discussione l'affermazione che actina sarà espresso in modo equivalente attraverso trattamenti). Figura 12. Un Western Blot esempio con una fila inferiore di bande di carico-controllo. Spesso queste bande rappresenteranno una proteina che è pensato per essere espressa in modo equivalente in tutti i trattamenti, come ad esempio actina. Guardando Figura 12, avevamo sperato per caricare quantità equivalenti di proteine ​​totali in ogni corsia, ma dopo aver eseguito il Western Blot, la dimensione e l'intensità delle barre inferiori in ogni corsia varia molto. Le due corsie di sinistra appaiono equivalenti, ma il 3 ° corsia ha la metà della densità (valore di grigio) rispetto a corsie 12, mentre corsia 4 ha la metà della densità e la metà delle dimensioni rispetto a corsie 12. Perché i nostri controlli di carico sono così diversi, la densità valori della serie superiore di bande non possono essere direttamente confrontabili. We8217ll usare ImageJ8217s gel analisi di routine per quantificare la densità e le dimensioni delle macchie, e utilizzare i risultati dei nostri controlli di carico-(bande inferiori) per scalare i valori per la nostra proteina di interesse (banda superiore). 1. Aprire l'immagine Western Blot in ImageJ. 2. Assicurarsi che l'immagine è in modalità a 8 bit: andare a ImagegtTypegt8 bit. 3. Utilizzare lo strumento rettangolo per disegnare una casella intorno a tutta la prima corsia (entrambe le barre superiori e inferiori inclusi. 4. Premere 822.018.221 (o Comando 1 su Mac) per impostare il rettangolo. A 822.018.221 dovrebbe apparire al centro del rettangolo. 5. Fare clic e tenere premuto il centro del rettangolo e trascinarlo nel corso del 2 ° corsia. 6. Premere 822.028.221 (comando 2 su Mac) per impostare il rettangolo di corsia 2. 822.028.221 dovrebbe apparire al centro del rettangolo. 7. Ripetere i passaggi 5 6 per ogni successivo corsia, premendo 822.028.221 (comando 2 su Mac) per impostare il rettangolo sopra ogni corsia successiva (vedi figura 13). Figura 13. ogni corsia è stata selezionata, spostando il rettangolo su di esso e premere 822.028.221 per impostare il rettangolo in atto. 8. Dopo aver effettuato l'ultima corsia (e pressato 822.028.221 per impostare in posizione), è possibile premere 822.038.221 per produrre un grafico delle corsie selezionati (vedi Figura 14). Figura 14. trama del profilo di ciascun corsia (organizzato con corsia 1 in alto, corsia 4 in basso). potrebbe essere necessario scorrere la finestra per vedere tutte le corsie. 9. La trama profilo rappresenta sostanzialmente il valore medio della densità attraverso un insieme di fette orizzontali di ogni corsia. macchie scure avranno picchi più alti, e le macchie che coprono una gamma di dimensioni più grandi (KD) avranno picchi più ampi. Nel nostro esempio Western Blot, le bande sono rettangoli perfetti, ma si noterà una certa pendenza nei picchi profilo trama, come ImageJ sta applicando un po 'di media dei valori di densità che si muove da cima a fondo di ogni corsia. Come risultato, la transizione netta da perfetto bianco al nero perfetto sulle bande di corsia 1 viene tradotto in una leggera pendenza del terreno profilo a causa della media. 10. Sul nostro Western Blot idealizzato usato qui, non c'è rumore di fondo, in modo che il picco raggiunge tutta la strada fino alla linea di base della trama profilo. In Western blot reali, ci sarà qualche rumore di fondo (lo sfondo non sarà perfettamente bianco), in modo che i picchi won8217t raggiungono la linea di base della trama profilo (vedi sopra la figura 5). Come risultato, ogni trama sarà necessario disporre di una linea tracciata attraverso la base del picco a chiuderla. 11. Scegliere lo strumento di selezione linea retta dalla barra degli strumenti ImageJ. Per ogni picco si desidera analizzare nella trama profilo, tracciare una linea attraverso la base del picco per racchiudere il picco (Figura 7). Questo passaggio richiede un po 'di giudizio soggettivo da parte vostra per decidere dove finisce il picco e il rumore di fondo comincia. 12. Quando ciascuna picco di interesse è chiuso con lo strumento linea retta, passare allo strumento Bacchetta. Useremo lo strumento bacchetta di evidenziare ogni picco di interesse in modo che Immagine-J può calcolare la sua relativa areadensity. 13. inizieremo mettendo in evidenza le bande di carico-controllo (fila in basso) sul nostro esempio Western Blot. Cominciando dalla parte superiore della trama profilo, utilizzare la bacchetta per fare clic all'interno della 1 ° picco (Figura 15). Il picco dovrebbe essere evidenziata dopo aver fatto clic su di esso. Continuare a fare clic sui picchi di carico-controllo per le altre corsie. Se una corsia non è visibile nella parte inferiore della trama profilo, tenere premuto la barra spaziatrice e fare clic e trascinare la trama profilo verso l'alto per rivelare le restanti corsie. Figura 15. Fare clic all'interno del picco di carico-controllo con lo strumento bacchetta. Click on each of the loading-control peaks for the remaining lanes (ignore the protein lanes to the left for now). 14. When the loading control peak for each lane has been highlighted with the wand, go to AnalyzegtGelgtLabel Peaks. Each highlighted peak will be labeled with its relative size expressed as a percentage of the total area of all the highlighted peaks. You can go to the Results window and choose EditgtCopy All to copy the results for placement in a spreadsheet. Figure 16. Area and Percent values for our loading-control bands from the example western blot. Lanes 1 and 2 are equal, as we expect by looking at the original bands on the western blot (Figure 12). 15. Repeat steps 13 14 for the real sample peaks now. We are selecting these peaks separately from the loading-control peaks so that those areas are not factored into the calculation of the density of our proteins-of-interest. As before, use the Wand tool to click inside the area of the peak in the 1st lane, then continue clicking inside the peaks of the remaining lanes. When finished, go to AnalyzegtGelgtLabel Peaks to show the results. Copy the results to a spreadsheet alongside the data for the loading-control bands (Figure 17). Figure 17. Results from the loading-control bands (labeled 8220stds8221 here) and the sample protein peaks (the upper row of bands on the original western blot). Data Analysis with loading-control bands 1. With all of the relative density values now in the spreadsheet, we can calculate the relative amounts of protein on the western blot. Remember that the 8220Area8221 and 8220Percent8221 values returned by ImageJ are expressed as relative values, based only on the peaks that you highlighted on the gel. Start the analysis by calculating Relative Density values for each of the loading-standard bands. In this case, we8217ll pretend that Lane 1 is our control that we want to compare the other 3 lanes to. Divide the Percent value for each lane by the Percent value in the control (Lane 1 here) to get a set of density values that is relative to the amount of protein in Lane 18217s loading-control band (Figure 18). Figure 18. Calculate Relative Density values by dividing the Percent values in each row by the control sample8217s Percent value (Lane 1, 40.828, in our example). 2. Next we8217ll calculate the Relative Density values for our sample protein bands (upper row on the example western blot). We carry out a similar calculation as step 1, dividing the Percent value in each row by the Percent value of our control8217s protein band (Lane 1 here). Figure 19. Calculate Relative Density values for the Samples as well, using the Percent value for your control protein band (Lane 1, 40.585 here). Note: Recall that because some of our loading-control bands were wildly different on the original western blot, we can8217t simply use the Relative Density values from our Samples calculated in Step 2 as the final results. Now it is necessary to scale the Relative Density values for the Samples by the Relative Density of the corresponding loading-control bands for each lane. We do this based on the assumption that the proportional differences in the Relative Densities of the loading-control bands represent the proportional differences in amounts of total protein we loaded on the gel. In our example western blot, we have evidence of massively different amounts of total protein in each sample (poor pipetting practice, probably). 3. The final step is to scale our Sample Relative Densities using the Relative Densities of the loading-controls. On the spreadsheet, divide the Sample Relative Density of each lane by the loading-control Relative Density for that same lane. Figure 20. Adjusted Density values (yellow cells) for our samples were calculated by dividing the Relative Density of each Sample lane by the Relative Density of the loading-control for the same lane. For example, the Relative Density for Sample 4 (0.1628) was divided by the Relative Density for the loading-control in Lane 4 (0.154379) to get an Adjusted Density value of 1.054. 4. When we created our imaginary example western blot, we expected to get equivalent amounts of the protein of interest in each lane, because we (hypothetically) loaded equivalent sample volumes of protein from the same vial of homogenate in each lane. During the loading process, something went awry, and we got very different densities on the western blot. But after carrying out the loading-control corrections above, we find that our Adjusted Densities for each of the 4 lanes are roughly equivalent (all are approximately 1), indicating that there are equivalent ratios of the protein of interest contained within the sample of total protein in each lane, as we would expect. The example above represents a special case. In reality, you will typically be skilled enough to pipette equivalent amounts of total protein into your gel lanes, presumably because you have used a process like the BCA Protein Assay to quantify the total amount of protein present in each of your homogenate samples. This can obviate the need for the loading-control bands and the associated controversy about whether the protein you8217re using to assess equal loading is truly expressed consistently across all treatment levels. Extending the example to multiple western blots If you can apply equal amounts of total protein to each lane of a gel, then you only need to concern yourself with having an appropriate standard sample placed on each western blot you run for the project. For example, you might purchase an aliquot of purified Human Hsp70 and place 1l in a lane on each gel you run when probing for Hsp70. Or you might save some money by creating your own standard sample by mixing aliquots of several of your homogenates to make a large quantity of mixed homogenate that you can use to load a standard volume onto a single lane of each gel for your entire project (running out of this mixture part way through your project would be a Bad Thing). In this case you may not know the true concentration of the protein of interest in your mixed homogenate, but you will at least be able to get an equivalent amount of total protein (including the protein of interest) on each gel. The goal of the standard sample is to account for variations in antibody binding efficiency (for example if you8217re re-using a mixture of antibody on multiple western blots to save money), for variations in blocking and washing efficiency, for variation in the decay rate of a chemiluminescent reagent used to visualize the antibodies, or for variation in the exposure time of your x-ray film. In any of these cases, the intensity of the signal you get out of your western blot can vary from blot to blot (Figure 21). You can use a standard sample on each gel to normalize every other band on that same blot, and then compare across multiple blots because every band in your dataset is normalized to the same standard (be it 10ng of Human Hsp70 or a mixture of several homogenates). Figure 21. Two example western blots with a common standard sample (Lane 1). The bindingincubationdevelopment steps of these two blots varied slightly, resulting in a different final exposure which alters the absolute densities on the two blots. Because we have a standard sample on both blots, which is an identical volume of an identical protein sample (i. e. drawn from a common aliquot of homogenate), we can express the densities of the other lanes on each gel relative to the standard sample, eliminating the effects of the differing exposures. Finally, if you are using a loading-control protein band (lower row on these blots) on each gel, and a standard protein sample on multiple gels, you can correct both for differences in total protein loaded in a lane (using the loading-control band) and for differences in exposure between gels (using the standard sample). For example, consider the two gels in Figure 21. The 1st (white) gel has minimal background noise, and there is some variation the amount of protein loaded in each lane, as revealed by the size and density of the loading control bands of the samples. The 1st lane on the left is our standard sample used on each gel. The 2nd (gray) gel has more background noise due to a different exposure time, poor washing, or any number of possible problems. Again, there are different protein quantities loaded in the 4 lanes, based on the size and density of the loading-control bands on the lower half. The 1st lane on the left is the same standard protein sample as that used on the 1st gel. We would start by analyzing the two gels separately, using the protocol in the loading-control portion of this document. 1. Calculate the relative density of the loading-control bands (lower row on this gel). Use the loading-control band for the standard in lane 1 to do this calculation. 2. Calculate the relative density of the bands for the protein band of interest (upper row on this gel). Use the protein band of interest for the standard in lane 1 to do this calculation. 3. Adjust the relative densities calculated in Step 2 using the relative densities for the loading-control bands calculated in Step 1. Simply divide the relative density from Step 2 for each lane by the corresponding relative density from Step 1. After you8217ve scaled the density of the protein of interest for each sample to the standard sample, and adjusted the relative density based on the loading-control band, you are left with an estimate of the relative density of the protein of interest in each lane on your gel (relative to the standard in lane 1). Repeat this for each separate gel. When finished, you8217ll note that because every sample lane is normalized to the standard sample in Lane 1 on that particular gel, and every gel contains the same standard sample, your cross-gel comparison is already accomplished, since every sample is now normalized to the same standard sample (Figure 22). Figure 22. Example data from two western blots. The Relative Densities of the loading-control bands (lower bands on each gel, red and yellow lines) was calculated, using the value for the standard in Lane 1 (lower band) on each gel. The Relative Densities for the sample bands (upper row on each gel, blue and green lines) were calculated separately, and were normalized relative to the standard in Lane 1 (upper band). The 8220Adjusted Density8221 for each sample lane was calculated by dividing the sample relative density by the loading-control relative density for each lane separately (i. e. for sample 3, 0.1857960.188449 0.98592). After all of this work, you8217re left with (adjusted) Relative Densities for each of your samples (the yellow cells in Figure 22). At this point you can ignore the values of the standard samples, since you only needed those to ensure that your cross-gel comparisons were scaled properly. Now you can finally begin calculating average relative density values for your experimental control samples (maybe these are samples 36) and your experimental treatment samples (perhaps these are samples 14 and 25) to carry out the real comparison of protein expression under your treatment conditions. Because your relative density values are all normalized to the standard sample, you may wish to eventually re-scale your relative density values once again using your experimental controls8217 average value as a baseline. A few extra details: With regard to the ImageJ gel analysis routine, there has been some question of what the values reported by ImageJ correspond to. The images below may help illustrate what Image-J is measuring. Figure 25. A comparison of 8220area8221 values returned by ImageJ. In Figure 25 above, I have drawn out a set of fake 8220bands8221 in Adobe Illustrator. The gray value and area of each band are listed above the band (in this case a lower pixel value darker band). Additionally, I have included the 8220area8221 value returned by Image-J after plotting the bands and clicking in each peak with the Wand tool. Note that these 8220area8221 values are a RELATIVE measure of the size and density of each peak you clicked with the wand tool. When you halve the area of a band, but maintain the same gray value (compare lanes 12), the value reported by ImageJ is half as large. By the same token, if you halve the gray value but maintain the same area (compare lanes 15), the value reported by Image-J is halved. Figure 26. Image-J will return similar area values when bands have equivalent numbers of pixels of equal darkness, but vary in shape. The same holds true for bands of different shapes. In Figure 26 above, altering the shape of the band, but maintaining the same gray value and area (compare lanes 13) yields an equivalent value from ImageJ. Figure 27. Image-J deals with gaps in bands just fine. Note however that the 8220area8221 values returned by ImageJ are different compared to Figure 26 and Figure 27, because the number of lanes, size of the bands, and density of the bands has changed. Image-J also accounts for gaps in a band, as shown in Figure 27 above. Compare lanes 13, which both have an equal number of gray pixels and equal gray values (i. e. equal amounts of protein on the gel). ImageJ reports the same 8220area8221 value for both of these lanes. It is worth reiterating that the 8220area8221 values and percentages reported by Image-J are always relative to the total size and density of bands that you have selected in a particular image. In the image immediately above (Figure 27), the band in column 1 returns an 8220area8221 value of 4000, while in the previous two images column 1 (Figs 25 26) had the same size band, but with twice the gray value, which in both cases also returned a value of 4000. The raw values returned by Image-J are meaningless for comparing across different gels, since they are only a relative measure of the bands you8217ve highlighted on a particular gel image. This is why we need to standardize to some common standard loaded onto all of the gels. Additional references 8211 The methods outlined here are by no means canonical and there are plenty of subtleties to be considered in this sort of analysis. For more practical considerations of scanning and analyzing gel images, see the following papers: Gassmann, M. Grenacher, B. Rohde, B. and Vogel, J. (2009). Quantifying western blots: pitfalls of densitometry. Electrophoresis 30, 1845-1855. doi: Tan, H. Y. and Ng, T. W. (2008). Accurate step wedge calibration for densitometry of electrophoresis gels. Optics Communications 281, 3013-3017. doi: You can follow any responses to this entry through the RSS 2.0 feed. Both comments and pings are currently closed. Tau Pathology Induces Excitatory Neuron Loss, Grid Cell Dysfunction, and Spatial Memory Deficits Reminiscent of Early Alzheimers Disease Hongjun Fu 1,4 Gustavo A. Rodriguez 1,4 Mathieu Herman 1 Sheina Emrani 1 Eden Nahmani 1 Geoffrey Barrett 1 Helen Y. Figueroa 1 Eliana Goldberg 1 S. Abid Hussaini 1,2,4 ,. Karen E. Duff 1,2,3,5 ,. 1 Taub Institute for Research on Alzheimers Disease and the Aging Brain, Columbia University Medical Center, New York, NY 10032, USA 2 Department of Pathology and Cell Biology, Columbia University Medical Center, New York, NY 10032, USA 3 Department of Integrative Neuroscience, New York State Psychiatric Institute, New York, NY 10032, USA Received 20 July 2016. Revised 20 October 2016. Accepted 15 December 2016. Available online 19 January 2017. Published: January 19, 2017 Highlights Tau pathology induces spatial memory deficits in old, but not young, EC-Tau mice Aged EC-Tau mice exhibit grid cell hypoactivity and reduced periodicity Excitatory, but not inhibitory, MEC neurons are vulnerable to tau pathology Altered neuronal activity correlates with neurodegeneration in old EC-Tau The earliest stages of Alzheimers disease (AD) are characterized by the formation of mature tangles in the entorhinal cortex and disorientation and confusion when navigating familiar places. The medial entorhinal cortex (MEC) contains specialized neurons called grid cells that form part of the spatial navigation system. Here we show in a transgenic mouse model expressing mutant human tau predominantly in the EC that the formation of mature tangles in old mice was associated with excitatory cell loss and deficits in grid cell function, including destabilized grid fields and reduced firing rates, as well as altered network activity. Overt tau pathology in the aged mice was accompanied by spatial memory deficits. Therefore, tau pathology initiated in the entorhinal cortex could lead to deficits in grid cell firing and underlie the deterioration of spatial cognition seen in human AD. tau pathology Alzheimers disease entorhinal cortex grid cells neuronal loss cognitive deficits neurofibrillary tangles spatial memory electrophysiology hypoactivity Figure 1. Figure 2. Figure 3. Figure 4.